RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription，RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，近年來得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。首先，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用，以RNA為模板，合成互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA），再以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛。獲得的cDNA可用于基因的擴(kuò)增、克隆，基因表達(dá)水平的檢測，細(xì)胞內(nèi)RNA病毒的含量等。
 
A．反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase，RTase）
自然界中廣泛存在著一類以RNA為遺傳物質(zhì)的反轉(zhuǎn)錄病毒，其攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板，合成cDNA的DNA聚合酶。目前在生命科研領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛的有鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）反轉(zhuǎn)錄酶（AMV RT）、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine L：Leukemin Virus，M-MLV) 反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）及其改造重組體M-MLV（RNase H－）。AMV RT具有反轉(zhuǎn)錄活性高、zui適反應(yīng)溫度較高（41～50℃）的特點，可以較好地克服由于模板二級結(jié)構(gòu)造成的逆轉(zhuǎn)錄困難問題，然而由于AMV RT的RNase H活性高，易降解cDNA-RNA復(fù)合物中的RNA鏈，導(dǎo)致合成的cDNA片段偏短，一般為1 kb左右。M-MLV RT的RNase H活性較低，合成的cDNA可達(dá)3~4 kb，比較適宜全長cDNA的合成。但M-MLV RT擴(kuò)增效率較低，zui適反應(yīng)溫度在37℃左右，故對于具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板逆轉(zhuǎn)錄效果不佳。經(jīng)過定點突變的M-MLV RT（RNase H－），基本上消除了RNase H酶活性，并將酶的zui適反應(yīng)溫度提高到42℃，大大提高了cDNA鏈的延伸性和產(chǎn)率，更適于完整基因的獲得。我公司提供的StarScript Reverse Transcriptase（Cat. No. A211）即為經(jīng)過多重定點突變、具有高擴(kuò)增能力的RNase H酶活性缺失型M-MLV RT，非常適合用于較長的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構(gòu)建等。
 
B．模板RNA
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中作為模板的RNA樣品可以是提取的總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。提取RNA的方法多種多樣，如單相試劑法（TRIGene，Cat. No. P118；TRIGene LS，Cat. No. P119）、過柱純化法、磁珠法等。無論使用哪種方法，zui關(guān)鍵因素是抑制RNA酶活性并zui大限度地去除基因組DNA污染。
 
C．引物
用于反轉(zhuǎn)錄的引物應(yīng)視實驗的具體情況選擇。常用的引物有Oligo(dT)12-18、隨機(jī)引物(Random Hexamer)和基因特異性引物(Gene-specific primer，GSP)。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種引物都可采用。Oligo (dT)12-18只適用于具有PolyA尾巴的RNA，對無PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類的真核生物的mRNA不適用。因Oligo (dT)12-18引物需與mRNA的PolyA尾結(jié)合，所以對RNA模板的質(zhì)量要求很高，即使模板有少量降解也會影響全長cDNA的合成量。隨機(jī)引物適用于任何類型的RNA模板，但由于特異性低，主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。基因特異性引物是根據(jù)模板序列設(shè)計的互補(bǔ)引物，特異性好，但僅適用于目的序列已知的情況。
 
D．其它影響因素
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)受多個因素的影響，如Mg2+濃度、引物退火溫度、擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。對于具有較高Tm值的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的優(yōu)化參見“1.7 RT-PCR常見問題及解決方案“部分。
 
E．一步法和兩步法RT-PCR
RT-PCR可以通過一步法或兩步法的形式來實現(xiàn)。一步法即將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一管內(nèi)完成，減少加樣步驟，有助于減少污染。由于所有的cDNA產(chǎn)物都用于PCR擴(kuò)增，其靈敏度非常高，尤其適用于檢測大量樣品和實時定量PCR。兩步法將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增分開進(jìn)行，在選擇DNA聚合酶（如高保真度、高特異性、長片段等）和引物時具有更大的靈活性。